導言：作為寫作愛好者，不可錯過為您精心挑選的10篇分子遺傳學綜述，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內容能為您提供靈感和參考。

篇1

中圖分類號：G642.0 文獻標識碼：C DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2013.23.150

動物遺傳學是動物科學專業的重要專業基礎課程。遺傳學具有基礎理論抽象、邏輯思維強、知識面涵蓋廣等特點，是動物育種的理論基礎。遺傳學的基本概念和原理來自于生產、生活和科學研究的實踐，遺傳學實驗是遺傳學教學中重要的環節，是理論教學的深化和補充。近些年，隨著遺傳學的不斷發展，取得了很多的進展，特別是隨著分子生物學的發展，遺傳學進入了全新的分子遺傳學時代，較之之前的形態遺傳學、細胞遺傳學而言，分子遺傳學更為抽象，因此，長期沿用下來的經典遺傳學實驗顯然已經不能滿足遺傳學快速發展的需求，從而對遺傳學相關實驗課提出了更高的要求。

針對以上情況，結合我校動物科學專業設置的實際情況，經過長期的摸索和創新，我校動物科學學院近年來開始開設了實用遺傳檢測技術課程，學時120學時。主要通過實驗制備和觀察，使學生從細胞、分子及群體水平上掌握遺傳學的實驗操作方法；學會基本儀器設備的使用技巧；了解遺傳學研究方法和手段，進一步加強學生獨立分析問題和解決問題的能力，獨立操作和創新能力及培養學生的動手能力。同時注意培養學生實事求是，嚴肅認真的科學操作和良好的實驗習慣，為今后的工作和研究打下良好基礎。本文將就本課程的設置進行綜述，旨在為相關學科今后在遺傳學相關實驗課程的開設方面提供借鑒。

1 細胞遺傳學篇

細胞遺傳學是研究細胞中染色體遺傳規律的學科。 同時也是在細胞層次上進行遺傳學研究的遺傳學分支學科。著重研究細胞中染色體的起源、組成、變化、行為和傳遞等機制及其生物學效應。

圍繞細胞遺傳學，設立了如下實驗項目：①細胞培養。主要講解細胞的體外培養原理、條件、技巧和注意事項。主要通過采集動物外周血培養2個周期，用以觀察培養細胞在體外分裂情況；②培養細胞的同步化處理。主要講解在體外培養條件下同步化處理的原理、條件、技巧和注意事項。處理培養細胞分裂中期同步化；③外周血淋巴細胞染色體標本制作。主要包括以下過程：收集細胞低滲處理固定涂片染色觀察；④骨髓細胞染色體標本的制備。主要包括以下過程：秋水仙素處理取管狀骨沖取骨髓細胞低滲處理固定涂片染色觀察；⑤果蠅唾液腺染色體標本的制備。主要包括以下過程：培養果蠅三齡幼蟲解剖分離唾液腺水解處理染色壓片觀察；⑥染色體顯G帶。主要包括以下過程：制備染色體標本片胰蛋白酶處理染色觀察；⑦各種顯微鏡的調試實用實踐。主要包括熟悉普通研究顯微鏡，相差顯微鏡，暗場顯微鏡，熒光顯微鏡的光路合軸、聚光器調焦、濾鏡選用等操作；⑧染色體標本的觀察照相。主要包括以下過程：顯微鏡下觀察制備好的染色體標本片統計分裂相的比例數細胞染色體數選形態良好數目占眾數的分裂相拍照；⑨染色體核型分析。主要包括以下過程：染色體照片photoshop軟件裁剪整理同源染色體配對排序測染色體臂長計算相對長度和臂比。

2 分子遺傳學篇

隨著遺傳學的迅猛發展，分子遺傳學已經滲透到了遺傳學的各個角度，分子遺傳學也因此在教學中已經占有了相當大的比重。分子遺傳學實驗技術也成為研究者使用得最多的分析手段，這就進一步要求我們的實驗教學也要適應遺傳學的發展。

圍繞分子遺傳學，設立了如下實驗項目：①動物組織（肌肉）中DNA的提取。主要包括以下過程：采集動物組織材料破壞細胞膜和核膜白和DNA分離抽提純化DNA乙醇沉淀DNA檢測DNA純度和量；②動物性別鑒定。主要包括以下過程：提取動物組織DNAsry特異引物PCR擴增電泳判斷；③DNA酶切電泳。主要包括以下過程：λDNA限制性內切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳檢測；④動物來源物種鑒定。主要包括以下過程：樣品采集基因組DNA提取PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷；⑤動物組織總RNA的提取。主要包括以下過程：樣品采集RNA提取瓊脂糖凝膠電泳檢測；⑥Total RNA質量的檢測及cDNA的制備。主要包括以下過程：紫外分光光度計檢測Total RNA質量反轉錄cDNA檢測；⑦microRNA指紋圖譜技術（MTFP）在肉品質檢測中的應用。主要包括以下過程：樣品采集總RNA提取及檢測cDNA的制備及檢測PCR反應及檢測PAGE電泳檢測和分析；⑧PCR-RFLP鑒定ABO基因型。主要包括以下過程：毛囊（毛發）中總DNA的提取及電泳檢測糖基轉移酶基因片段擴增及電泳檢測擴增片段限制性酶切及電泳檢測。

遺傳學是研究生物遺傳和變異的科學。隨著現代生物科學技術的發展，遺傳學已成為生命科學領域中發展最為迅速的基礎學科之一，而實驗實踐教學環節為培養學生的科學思維、探索思維和實踐創新能力提供重要途徑，并且可以提高學生的實際動手能力和分析問題、解決問題的能力。遺傳學實驗技術和方法是遺傳學建立和發展的基礎，如今現代的遺傳學實驗技術已廣泛滲透到生命科學的各個分支領域，并正在發揮其獨特的作用。本文通過數名長期工作在遺傳學本科教學一線的教師多年的教學實踐經驗，結合動物科學專業設置的特色，摸索了一套適合動物科學專業本科生實際的實驗課教學體系，旨在為培養理論與實踐兼備的高素質動物科學方向的本科生做出一定的貢獻，也期望為國內同行遺傳學教學相關實驗課的開設提供一定的借鑒作用。

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作者簡介：蘇蕊，內蒙古農業大學動科院，內蒙古呼和浩特 010018

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中圖分類號 S522 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）10-0039-02

Abstract Vigna radiata L. is an important economic crop used in medical and food industry.Breeding methods on Vigna radiata L. and genetic research progress were described.New ways and thoughts for reference were in prospect in this paper，including exploring of Vigna radiata L. germplasm resources and strengthenning of the Vigna radiata L. genetic studies. It provided theoretical basis and technical support for Vigna radiata L. breeding and genetic research，in order to improve the level of domestic Vigna radiata L. breeding and genetic research.

Key words Vigna radiata L.；breeding；molecular genetics；prospect

綠豆（Vigna radiata L.）屬于豆科，別名青小豆，因其顏色青綠而得名。綠豆在中國主要產區集中在黃河、淮河流域的平原地區[1]，生產經歷了高―低―高的發展歷程。綠豆營養豐富，可藥食兼用，又是食品工業的重要原料，有“食中佳品，濟世長谷”之稱[2]。

1 綠豆育種研究進展

1.1 綠豆種質資源的收集與評價

種質資源是農業生產、新品種選育、遺傳研究及生理生化研究的重要物質基礎。目前，全球收集和保存的綠豆種質資源共有3萬余份，世界上最大的收集和保存機構為亞洲蔬菜研究與發展中心亞洲區域中心[3]。1978年起，中國綠豆種質資源的搜集、農藝性狀鑒定和整理、保存被正式列入國家重點研究項目。由中國農業科學院作物品種資源研究所組織各省、市、區的有關科研單位開展了綠豆種質資源的收集、鑒定、保存和利用，從20多個省（市、自治區）共收集綠豆資源6 000余份，完成了逾5 600份品種農藝性狀的鑒定，并列入《中國食用豆類品種資源目錄》[4-5]。種質資源的收集是育種及資源深入研究的基礎。亞洲蔬菜研究與發展中心亞洲區域中心對收集的綠豆種質資源的進行分析與鑒定后，篩選出一批抗蟲、抗逆、農藝性狀較好的優質資源[3]。中國對2 200余份資源進行了抗病蟲、抗逆性鑒定及品質分析[6]，建立了資源評價數據庫，為綠豆品種選育時親本的選擇提供了參考[7-8]。

1.2 綠豆育種研究概況

G豆新品種的選育主要采用系統選育、引種、雜交及誘變等常規方法。通過對地方綠豆品種資源的評價與鑒定，保留適合品種，并大面積推廣，這些鑒定的新品系有效地解決了當地綠豆育種及生產中存在的問題，如印度的抗病品系和高蛋白品系。引進的品種可直接鑒定后進行種植，如從AVRDC引進的中綠1號、中綠2號等，對中國綠豆生產起到了極大的推動作用；引種還可豐富雜交親本的遺傳基礎，提高品種的綜合品質，許多育成的新品種都是由引進品種和地方品種雜交而來，如韓國裂葉品種Samgang、小粒品種Soseon[9-10]，巴基斯坦高產品種Ramzan[11]，中國品種豫綠2號、豫綠4號、冀綠9239、冀綠2號、濰綠1號等品種[12-14]，這些育成的新品種已成為當地的主栽品種。綠豆屬于自花授粉作物，人工雜交成功率較低，誘變育種是繼系統選育和雜交育種之后發展起來的一項新技術。1996年，中國學者對綠豆進行了空間誘變研究，獲得了一批穩定的綠豆變異品系[15]，科研人員利用γ射線誘變培育的晉綠豆2號適應性廣且產量高[16]，Khan等[17]利用SA（疊氮化鈉）誘變出的綠豆生育期顯著縮短，后代群體產生了廣泛的變異。

2 綠豆分子遺傳學研究

2.1 綠豆分子標記及遺傳圖譜的研究

分子標記方面，由于前期綠豆分子遺傳學研究比較落后，RAPD、AFLP 等常用標記方法應用比較頻繁，但RAPD技術不穩定，且RAPD和AFLP技術繁瑣且費用昂貴。因此，隨著技術的開發，基于PCR技術的標記技術應用越來越多，如SSR分子標記技術。Kumar等[18]利用錨定PCR技術開發的SSR引物在綠豆基因組及綠豆近緣種中都能擴增出特異性條帶，故這些開發的引物也可用于親緣關系分析及近緣種間的比較作圖研究。孫 蕾等[19]為了找到與抗豆象基因連鎖的分子標記，利用63個RAPD標記和113個SSR/STS標記分析群體，共找到了22個與抗性基因連鎖的分子標記。綠豆遺傳連鎖圖譜的構建及目標基因的定位將有效縮短育種周期，為基因精細定位、基因克隆及分子定向修飾育種等奠定基礎。如Lambrides等[20]利用抗豆象野生種ACC41及栽培種Berkern后代群體構建了2個綠豆遺傳連鎖圖譜。

2.2 綠豆相關基因克隆研究進展

目前，綠豆基因克隆及研究工作已起步，但對綠豆轉基因的研究還不成熟?？娊ㄥK等[21]利用綠豆葉片擴增出362 bp的綠豆防御素基因，對其進行序列比對后將其構建到植物表達載體中進行遺傳轉化分析。Chen等[22]分離了綠豆Hsc70的cDNA，并在轉錄和翻譯水平檢查了其表達水平，該基因屬于組成型表達基因，主要在生長發育過程中起作用。

3 展望

綠豆已成為我國種植結構調整及農民脫貧致富的重要經濟作物，國家已把綠豆列入現代農業產業技術體系中，綠豆的育種研究也取得了顯著成效，但從近年來新品種選育情況來看，資源利用率還比較低，一些潛在的優異資源還沒有被發掘出來。應繼續加強綠豆種質資源挖掘力度，繼續搜集和鑒定資源的遺傳多樣性，為綠豆育種提供特征明確的優良種質[23-24]。

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篇3

1 染色體異常

染色體異常或染色體畸變是指染色體的結構或數目發生了異常的變化，包括缺失、重復、易位和倒位4種類型。在21三體（Down綜合征）、13三體、15三體、18三體（Eward綜合征）、22q11缺失（DiGeorge 綜合征）和45X缺失（Turner綜合征）等一些染色體異常疾病中，VSD經常發生[4]。由于大約5%～8%的CHDs患兒存在染色體異常疾病，親代染色體異常在子代VSD發病中具有十分重要的影響。值得注意的是，杜玉榮等[5]的研究結果表明，VSD與22q11 微缺失有關，國外也有類似報道[6]。但22q11微缺失是否與單純CHDs的發生有關還需要進一步的研究證實。

2 基因改變

同大多數CHDs一樣，VSD是一種多基因病，其發病機制仍然沒有完全闡明?；虻娜笔?、重復和突變均可引起基因的改變。隨著分子生物學的飛速發展，可能與VSD發病有關的基因逐漸被人們所認識。

2.1 TBX5基因：TBX5 基因屬于T-box轉錄因子基因家族，定位于12q24.1，其cDNA全長2 441bp，有8個外顯子，編碼1個513個氨基酸的轉錄因子。TBX5轉錄因子在心臟、上肢芽和眼中表達。TBX5基因突變會使TBX5轉錄因子表達異?；虮磉_缺陷，這都將引起心臟發育不良和上肢畸形。對Holt-Oram綜合征家系的研究有力闡明了TBX5突變引起房間隔缺損（atrial septal defect，ASD）和VSD的機制[7，8]。

2.2 GATA4基因：GATA4基因屬于GATA家族，定位于染色體8p23.1，其cDNA全長1 856 bp，有9個外顯子，編碼1個438個氨基酸的轉錄因子，分子質量45 ku。GATA4基因是心臟前體細胞分化的最早期標志之一。有研究發現多種鋅指蛋白在VSD患兒中有不同水平地表達，而GATA4作為一種鋅指蛋白，在VSD患兒中表達水平下降[9]。

2.3 NKX2.5基因：NKX2.5基因屬于NK型同源核基因家族NKX2型的成員之一，定位于5q35，其cDNA全長1 585 bp，有2個外顯子，編碼1個324個氨基酸的轉錄因子，分子質量35 Ku。在兩個外顯子之間有約1.5 Kb的內含子，在其上游約9 Kb處有一含有GATA4的高親和位點的心臟增強子，對心肌細胞的分化、整個心管的形成與環化起到重要作用。有研究[10]表明NKX2.5突變是ASD發生的一種少見的致病原因，但除此之外，NKX2.5突變與VSD發生有關也得到了普遍認同。

有研究認為TBX5、GATA4和NKX2.5之間存在相互作用，它們的轉錄激活引發了VSD的形成[11]。H. Chen等[12]也進一步證實了上述幾個主要的心臟轉錄因子、BMP10與細胞周期調節蛋白之間的相互作用是影響孕中期心臟發育轉變的重要途徑。這也為我們更深入地理解VSD的發病機制提供了依據。Hao Zhang等[10]也發現了一些在VSD發展過程中發揮了重要作用的基因，這些基因涉及了能量代謝、細胞周期和分化、細胞骨架和細胞粘附、LIM蛋白和鋅指蛋白等過程和物質，它們的表達水平在VSD患兒中與正常人相比有很大的差異。

3 再顯風險率

目前，雖然還沒有VSD相關的染色體異常和基因改變的直接的分子遺傳學檢測，但是可以通過對生育人群的調查來評估它的再顯風險率。

4 展望

在最近的幾年中，隨著分子生物學和醫學遺傳學的不斷發展，不管是單純的VSD，還是作為某種綜合征的一部分，關于VSD致病基因的確認和特性研究都取得了一些有意義的進展?；蛲蛔儗е缕渌幋a蛋白的功能異常，影響特異信號轉導途徑或轉錄方式，從而產生異常的表型，這一觀點越來越受到重視和推崇。一個重要的例子就是Noonan綜合征，它與RAS/MAPK信號級聯反應異常有關[13]。由于心臟發育從整體上來看比較復雜，從而產生了許多的候選基因，高通量的基因測序技術使我們能夠發現更多的致病基因和已知基因的功能，從分子和基因水平闡明VSD或其它CHDs的致病機制。我們可以更加準確地完成對再顯風險率的預測，進一步提高早期診斷水平，為基因診斷和治療提供理論基礎。

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篇4

胃癌是消化系統的常見惡性腫瘤，為全世界范圍內發病率最高的癌癥之一，根據世界衛生組織癌癥研究中心2002年的統計，我國胃癌發病率僅次于日本，位于全球第2位。2007年中國腫瘤登記提示：我國胃癌的發病居第二位，僅次于肺癌，死亡據第三位，僅次于肺癌、肝癌。胃癌在演進過程中隨著附加的基因突變會產生不同的亞克隆，使其不斷異質化導致其侵襲和轉移能力不斷加強，而這是胃癌治療困難和致死的主要原因。國內外學者都在尋求能指導臨床方案選擇及判斷預后的胃癌分型，傳統的癌癥診斷對病理學依賴性較大，有時會因為腫瘤的不典型或臨床信息的不完整而造成診斷困難。應用基因分析技術所產生的信息，特別是應用高通量芯片技術所產生的信息可以為胃癌分型提供更多的參考，因此對目前胃癌相關的分型予以綜述。

1 胃癌的傳統分型

胃癌病理分型是以組織形態結構和細胞生物學特性為基礎，不同類型的胃癌，其形態結構和生物學行為各異，流行病學和分子機制亦不同，以致現有的胃癌分型系統眾多。目前，常用的是WHO型、Lauren分型，大體分型主要使用Borrmann分型。

1.1 WHO胃癌包括以下常見組織學類型

狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌、腺鱗癌、鱗癌、小細胞癌、未分化癌。此外，胃內還可以發生類癌。WHO分型將Lauren分型的腸型、彌漫型納入腺癌之下。其管狀腺癌還可進一步分成高分化、中分化與低分化腺癌。少見類型或特殊類型胃癌有：實體型變異、肉瘤樣變異等。

1.2 1923年德國病理學家Borrmann提出的一種胃癌大體形態分型方法，此分型主要根據癌瘤在黏膜面的形態特征和在胃壁內的浸潤方式進行分類，將胃癌分為4型：Ⅰ型（結節型），II型（潰瘍局限型），III型（浸潤潰瘍型），是最常見的類型，約占50%。Ⅳ型（彌漫浸潤型），由于癌細胞彌漫浸潤及纖維組織增生，胃壁呈廣泛增厚變硬，稱“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌經典的分型方法，既能反映胃癌的生物學行為，又簡潔實用，國際上廣泛采用。

1.3 Lauren分型將胃癌分成兩大主要類型，即腸型與彌漫型，當腫瘤內兩種類型成分相當時就稱為混合型。胃癌發生是一個多步驟的過程，彌漫型和腸型在腫瘤發生各個階段會產生多種基因及表觀遺傳學方面的變異。常見的包括抑癌基因的點突變和雜合性丟失，常見的表觀遺傳學異常包括CPG島的甲基化引起的腫瘤抑制基因沉默和腫瘤促進基因轉錄水平的增高。

2 胃癌分型與分子病理學

胃癌分型研究的意義在于探索其是否對判斷預后有價值或者對于今后的治療有指導意義。當前，國內張樹華采用組織病理與組織化學和免疫組織化學技術相結合的方法，兼顧宿主的免疫防御反應，把胃癌分為兩型：限制生長型和促進生長型。限制生長型預后較促進生長型好。

根據黏蛋白標記的差異，胃癌組織被分為4型：1）胃型：胃型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；2）胃腸型：胃型黏蛋白標記的胃癌細胞> 10%且腸型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；3）腸型：腸型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；4）未分類：胃腸黏蛋白標記的細胃癌細胞

Solcia等對對294例平均隨訪時間長達150個月的胃癌進行研究顯示，如果將胃癌的組織學結構、細胞異型性程度、p53基因突變、18q雜合性缺失、微衛星不穩定性以及有無脈管神經浸潤等因素與預后綜合分析，可以將胃癌惡性程度分成三級。胃癌I級（預后良好型）包括：大量腫瘤內/旁淋巴樣細胞反應型、高分化管狀腺癌、黏液結節型和促纖維結締組織增生性彌漫型胃癌，I級胃癌約占全部胃癌病例的37%。胃癌III級（預后不良型）包括：高度異型性胃癌、浸潤型黏液腺癌、腫瘤細胞異型性中等但具有p53基因的第7或第8外顯子突變、伴有血管淋巴管浸潤以及神經浸潤者，III級胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌則歸屬于預后中等的胃癌Ⅱ級，占全部胃癌的44%。這一關于胃癌惡性程度評價體系雖然是不依賴于臨床分期的胃癌預后判斷新標準，但實際操作中涉及到微衛星不穩定性的分子遺傳學檢測、p53基因突變檢測以及EB病毒原位雜交檢測等實驗技術，在臨床普及以及操作流程標準化控制等方面均有待統一。

3 微衛星不穩定性與胃癌分型

微衛星不穩定性[MSI]是胃癌發生過程中的一個常見事件，反應了腫瘤潛在DNA錯配修復缺陷，常常由Hmlh1啟動子區甲基化引起，胃癌合并MSI者其臨床病理因素特別，預后相對良好，胃腸道腫瘤中MSI的測定是最先被廣泛利用的預后分子檢測之一。MSI的檢測常采用熒光定量多重PCR進行，費用相對低，適用性廣。以往的很多觀察表明，胃癌中MSI的存在不僅僅是與已知的與組織病理特征強關聯的分子分型標志，同時MSI能能區分預后良好好亞組。因此Simpson等建議將MSI作為一個有效的分子分型工具。葡萄牙的一項研究表明，胃癌患者并低度MSI五年生產率為30%相比，而高度MSI者則為70%。韓國的一項大型研究也表明在胃癌分期為II、III期的患者MSI與預后良好有關。

4 胃癌的分子分型

以分子特征為基礎的新型分類體系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多態性分析、DNA甲基化分析和基因拷貝數分析.也可以是RNA水平的基因表達譜分析、微小RNA表達譜分析和蛋白表達水平的蛋白芯片分析等。

腫瘤分子分型的基礎：目前可以在DNA、RNA和蛋白質水平上進行腫瘤分子分型的研究。在DNA水平，可以依據基因突變、基因組的細胞遺傳學改變或甲基化差異進行分型。根據基因表達譜（RNA水平）的差異實施分型，是目前分子分型的研究主體，以表達譜芯片為基礎的分子分型研究數據處理分二類：一是，unsupervised analysis；二是，supervised analysis。在蛋白質水平，可以根據蛋白質表達譜的差異，亞細胞結構蛋白組成的不同或蛋白質翻譯后修飾的改變來進行分型。

篇5

1基因診斷

基因診斷(gene diagnosis)又稱DNA診斷或分子診斷，通過從體內提取樣本用基因檢測方法直接檢測基因結構及其表達水平的改變，檢測病原體基因型，進而判斷是否有基因異?；驍y帶病原微生物，或利用分子生物學技術從DNA水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷。應用基因診斷技術可以針對已確診或擬診遺傳性疾病的患者及其家系成員，根據遺傳學的基本原理，通過分子生物學的實驗手段檢查被檢個體相關基因的異常，確定隱形攜帶者狀態及在癥狀出現前的疾病易感性等，從而達到臨床確診的目的。因此，基因診斷迅速在臨床診斷領域特別在遺傳病研究領域得到了較為廣泛的應用。目前的基因診斷方法主要有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應及相關技術、DNA序列測定、DNA芯片、連鎖分析等。

2單基因遺傳病

單基因遺傳病是指由單個基因異常導致且以孟德爾方式遺傳的疾病，是我國常見出生缺陷的重要原因之一，較為常見且研究較多的有血友病、苯丙酮尿癥(PKU)、肝豆狀核變性、地中海貧血等等。除部分單基因遺傳病可通過手術加以矯正外，絕大部分遺傳病是致死、致殘、致畸性疾病，且目前均無法治療，進行遺傳性疾病的產前診斷，是避免致死、致殘、致畸性疾病胎兒出生的重要手段。

3基因診斷的應用

3.1在B型血友病中的應用

血友病B(hemophilia B)是因凝血因子Ⅸ(FlX)基因缺陷引起的x-連鎖隱性遺傳出血性疾病，在男性中的發病率約為1／30000，散發率可達患者總數的30％-50％[1]由于目前還不能根治，對于攜帶者和高危胎兒進行基因診斷非常必要。血友病B基因缺陷類型十分繁多，基因缺陷包括缺失、插入和點突變，其中80％左右為單個堿基突變[2]。目前已發現的突變位點中，除了導致氨基酸序列改變的突變外，還發現不少的CpG區、剪切位點的突變[3]。常用于血友病B連鎖分析的方法有限制性片段多態性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)和短串聯重復序列分析，但在中國人群中具有多態性的酶切位點很少。王學鋒等[4]利用這6個短串聯重復序列（STR）位點對8個血友病B家系進行連鎖分析，診斷率達到99.99％。王莉等[5]在研究家系1和家系2中，發現分別有2個和3個位點可以提供信息，結果支持2例胎兒均未獲得風險染色體，這與突變分析結果一致。連鎖分析適于有家族史的血友病B或無家族史但攜帶者明確的產前診斷，且實驗操作和結果分析相對簡單，適用臨床開展應用，是一種快速和有效的基因診斷方法

3.2在地中海貧血中的應用

地中海貧血是一組常染色體隱性遺傳病。它是由于珠蛋白基因突變，使珠蛋白生物合成受阻、產量不足或缺如所致。地中海貧血常見有兩種類型：α-地中海貧血和β-地中海貧血。β -地中海貧血是由于β珠蛋白基因突變導致β珠蛋白鏈合成障礙的慢性溶血性貧血。β珠蛋白基因位于11號染色體短臂(1lpl5)。絕大多數β-地中海貧血是由于基因發生點突變所致，少數為基因缺失所致。突變基因特異型擴增系統(amplification refractory mutation system)法能快速鑒別診斷β-地中海貧血，簡便可靠，可用于中國人非缺失型地中海貧血的基因診斷和產前診斷，便于基層單位應用。α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血在我國則以南方地區多見，如廣西、廣東、四川、云南等地。由于大部分α-地中海貧血是由于α-基因缺失所致，因此可運用基因診斷法對α-基因進行檢查，針對α-地中海貧血的診斷具有重大的現實意義。基因診斷的探測目的物至少包括DNA和mRNA。Mullis建立PCR技術，多年來，這種技術在實際運用中發揮了重要的作用，為遺傳病的診斷提供了更加可靠的依據。PCR是利用DNA聚合酶等在體外條件下，催化一對引物間的特異DN段合成的基因體外擴增技術。Southern雜交是研究DNA圖譜的基本技術，在分析PCR產物和遺傳疾病診斷分析等方面有重要價值，它被認為是分析α珠蛋白基因缺陷的金標準。根據每個突變位點的特異擴增帶來判斷結果，在診斷各種缺失型α-地中海貧血時便于臨床推廣[6]。

文婕等[7]引進簡便、快速的多重PCR技術、PCR-RFLP方法和PCR-RDB法，可準確地進行地中海貧血基因診斷。用于地貧高危胎兒的產前診斷中，對預防重型患兒出生有較好的臨床價值。從112例疑似地貧的患者中檢出α-珠蛋白基因突變和β-珠蛋白基因突變患者共59例,研究表明，α-地貧95％以上為缺失型，其分子基礎主要是α-珠蛋白基因大片段缺失。限制性片段長度多態性(RFLP) 連鎖分析法[8]是用相應的內切酶對正常產物和突變產物進行水解并電泳分離，從而檢測地貧基因。基因芯片診斷技術在核酸擴增的基礎上，采用熒光標記及引物延伸的方法，可提高檢測結果的敏感性和特異性，由于基因芯片高通量特點，可將α、β地中海貧血基因診斷在一張芯片上完成，適用于大面積普查[9]。

3.3在苯丙酮尿癥中的應用

苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）是兒科常見的氨基酸代謝病，因苯丙氨酸羥化酶基因突變導致PAH活性降低或喪失，過量苯丙氨酸和旁路代謝產物的神經毒性作用造成患兒嚴重智能障礙和繼發性癲癇。國內外普遍開展的新生兒疾病篩查是診斷PKU的有效方法，而基因診斷較之生化篩查方法的優勢在于能從DNA 水平了解病因，診斷特異性高，在個體發育的任何階段，任何有核細胞都可以進行診斷，同時也為產前診斷和潛在新治療方法的研究提供依據。Sudha Kohli等[10]采用該多態標記對一例PKU家系進行分析，結果先證者遺傳了來自母親的致病的等位基因1，而胎兒則遺傳了來自母親的正常的等位基因2，從而對胎兒作出了確診。宋等［11］利用測序技術檢測了北方地區230例PKU患兒PAH 基因全部外顯子，發現75種不同的突變（94.6％），其中3種為新發現位點。基因診斷結果可能預知PKU的病情輕重程度，指導臨床分類和治療［12］。

3.4在肝豆狀核變性中的應用

肝豆狀核變性又稱Wilson病(Wilson's disease，WD)，是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙性疾病。WD為目前少數可以治療的神經遺傳病之一，患者如果能在發病早期或癥狀前期即被確診并得到及時治療，大多預后良好，反之，病情逐漸加重甚至危及生命[13]。雖然典型的WD患者根據特征性臨床表現及實驗室銅代謝檢查等不難診斷，但許多患者早期癥狀復雜多樣，極易被誤診為其他疾病[14]，銅代謝檢查又存在假陰性或假陽性結果[15]，因此，本病的早期診斷特別是癥狀前期和產前診斷較為困難。近年來，伴隨基因組計劃出現和發展起來的DNA微陣列技術以其固有的小型化、并行性和高通量等特點，在生物分子信息獲取，特別是生物基因組的再測序、基因多態性的信息檢測和基因表達監測等方面得到了快速的發展和應用。DNA微陣列技術與WD基因高度遺傳異質性的特點相契合，是一種極具潛力的WD基因檢測工具。2003年，Baner等[16]采用等位基因特異性封閉探針(allele-specific padlock probes)結合DNA微陣列技術對75例歐美裔WD患者13個基因突變及多態位點進行檢測，經DNA測，序結果證實其準確率達100％。首次證實了該技術用于WD基因診斷的可行性。Harmut等開發了一種可以檢測60種WD基因突變的DNA微陣列芯片，但仍不能包含一些少見的和新發現的突變[17]。因此，該技術目前尚處于研究探索階段，加之建立DNA微陣列技術平臺投入不菲，其面向臨床應用尚需待以時日。

4結語

隨著“人類基因組計劃”的完成和“后基因組計劃”的實施(即是對基因功能的研究和基因與人體疾病關系的研究)，分子生物學技術將會越來越普及、方便地運用到基因診斷領域?，F代生物科學和其他學科技術的不斷發展和完善，在不久的將來，即可把所有的基因都固定于1塊芯片上時，就成了一塊多基因疾病檢測的萬能芯片，它可適用于任何多基因疾病的檢測，為臨床檢測工作帶來極大的便利。總之，分子生物學和分子遺傳學的飛速發展必將極大的促進基因診斷技術的進步。有理由相信，以基因診斷為基礎的基因治療必將成為人類治療自身疾病的主流技術，并極大地促進人類衛生事業的進步。

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篇6

近年來，隨著分子生物學技術的發展，靶向化療藥物的不斷出現，聯合化療以及造血干細胞移植的不斷改進，兒童急性淋巴細胞白血?。╝cutelymphoblasticleukemia,ALL）的療效顯著提高，其長期生存率可達90%[1]。盡管如此，仍有15%~20%兒童ALL出現復發，并成為ALL患兒獲得長期生存的主要障礙和死亡的重要原因。因此，進一步尋找與復發ALL預后相關的分子遺傳學異常是未來的研究方向。2009年，DenBoer等[2]和Mullighan等[3]首次發現約有15%~19%遺傳學分型不明的B-ALL患兒基因表達譜與BCR-ABL1陽性ALL患兒相似，預后也與其相似，將其稱為Ph-likeALL，其基因組學改變的共同特征為存在細胞因子受體基因突變和激酶信號通路異常活化，針對這些信號通路的激酶抑制劑已經使部分患者獲得了更好療效[4]。本文就近年來兒童Ph-likeALL的研究進展作一綜述。

1Ph-likeALL的基因改變與發病機制

1.1JAK激酶通路基因異常

1.1.1CRLF2基因重排與過表達

CRLF2（cytokinereceptor-likefactor2）基因位于性染色體Xp22.3或Yp11.3，編碼細胞因子受體樣因子-2，也稱胸腺基質淋巴細胞生成素受體（thymicstromallymphopoietinreceptor,TSLPR）。TSLPR是一種I型細胞因子受體，與配體TSLP結合后可與白介素7受體（IL-7R）的α鏈形成異源二聚物，啟動下游的JAK-STAT信號通路，參與淋巴細胞增殖的調控[2,5]。42%的兒童Ph-likeALL存在CRLF2基因異常，以易位最常見，主要形成IGH-CRLF2和P2RY8-CRLF2兩種重排基因，導致CRLF2過表達[6]。部分Ph-likeALL存在其他未知因素導致CRLF2過表達[7]。而CRLF2過表達將持續活化下游JAK-STAT信號通路，導致白血病細胞持續增殖。此外，CRLF2的F232C點突變（第232位氨基酸由半胱氨酸代替苯丙氨酸）可促使非配體依賴性的同源二聚體形成而異?；罨掠涡盘柾穮⑴c白血病發生[8]。值得注意的是，CRLF2-IL7R-JAK-STAT通路激活并非僅存在于Ph-likeALL，約60%唐氏綜合征ALL患兒也存在此通路異?；罨痆9]。

1.1.2JAK基因突變與重排

CRLF2過表達的Ph-likeALL中，約50%伴有JAK基因突變，以JAK2R683突變最多見[8,10]。JAK基因突變一方面導致CRLF2或IL-7R發生激活突變，另一方面使編碼抑制JAK的接頭蛋白LNK的SH2B3基因發生失活性突變，從而活化JAK-STAT信號通路，這亦提示CRLF2的過表達和JAK基因突變在活化JAK-STAT信號通路中有協同作用[4]。在兒童Ph-likeALL中，JAK基因家族除發生突變，約5%存在JAK2基因重排。目前文獻報道共計10種基因與JAK2形成融合基因，包括PAX5-JAK2、BCR-JAK2、ETV6-JAK2、SSBP2-JAK2、ATF7IP-JAK2、EBF1-JAK2、PPFIBP1-JAK2、STRN3-JAK2、TERF2-JAK2和TPR-JAK2，其產生的融合蛋白保留JAK2的激酶區域并持續激活，導致JAK-STAT信號通路持續活化[11]。

1.1.3紅細胞生成素受體基因重排

紅細胞生成素受體（erythropoietinreceptor,EPOR）基因重排見于4%的兒童Ph-likeALL，主要形成EPOR-IGH、EPOR-IGK和EPOR-LAIR1融合基因，即EPOR基因易位到免疫球蛋白重鏈（IgH）或輕鏈（IgK）的增強子區和LAIR1的上游區域，這一改變導致截短型EPOR過度表達，對EPO呈高敏感，激活JAK-STAT信號通路，早期參與白血病的形成[12]。

1.2ABL激酶通路基因異常

不同于JAK通路基因的異常，ABL基因異常只涉及重排。約14%的兒童Ph-likeALL存在ABL家族基因重排，包括ABL1、ABL2、PDGFRB及CSF1R基因，這些基因雖然存在眾多且不確定的伙伴基因（見表1），但其轉錄產物的結構與功能均與BCR-ABL融合蛋白類似，可使酪氨酸激酶異?；罨瑢е录毎掷m增殖。PDGFRB（platelet-derivedgrowthfactorreceptorβ）基因編碼血小板衍生生長因子受體β，其為Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族的一員[14]。PDGFRB重排最早在骨髓增殖性腫瘤中發現，但目前發現ALL中也有PDGFRB特征性重排，以EBF1（earlyB-cellfactor1）-PDGFRB融合基因最常見。EBF1是B系淋巴細胞分化必需的轉錄因子，EBF1的編碼區與PDGFRB的羧基端融合，一方面影響EBF1的正常功能，使細胞分化停滯于淋系B前體細胞階段，另一方面致PDGFRB過表達，導致細胞持續增殖[13]。集落刺激因子1受體（colonystimulatingfactor1receptor,CSF1R）基因是巨噬細胞集落刺激因子（macrophagecolonystimulatingfactor,M-CSF）受體的編碼基因，其激活見于粒單核細胞白血病，而在Ph-likeALL中CSF1R可與單鏈DNA結合蛋白基因SSBP2形成SSBP2-CSF1R融合基因，持續的細胞因子受體信號可使SSBP2被ABL1磷酸化而參與腫瘤形成[15]。

1.3淋系轉錄因子基因異常

淋系轉錄因子基因主要包括EBF1、PAX5和IKZF1[11]。IKZF1編碼的鋅指轉錄因子IKAROS是淋巴細胞發育、分化過程中的一種重要轉錄因子。50%~70%的Ph+和PhlikeB-ALL存在IKZF1的遺傳學改變[16]，主要為IKZF1的單等位基因丟失、內部外顯子缺失和移碼、錯義突變，導致IKROS劑量不足或產生突變型IKROS，從而使B細胞發育停滯，同時增強激酶依賴的細胞增殖和更新[17]。此外，突變型IKROS自身蛋白功能受損的同時還可以顯性失活的方式影響正常IKAROS。Witkowski等[18]研究發現IKZF1基因突變可激活B-ALL中大量與細胞增殖和耐藥相關的基因，但具體機制仍不明確。PAX5和EBF1基因也是B細胞發育早期所需的轉錄因子，其與激酶基因易位形成融合基因如PAX5-JAK2、EBF1-JAK2、EBF1-PDGFRB，不僅阻滯細胞分化，同時亦促進細胞增殖[19]。

1.4其他基因異常

在Ph-likeALL中，SH2B3基因的失活性突變導致銜接蛋白LNK量減少，刺激IL7激活JAK-STAT信號通路，導致細胞持續增殖[20]。IL-7R、FLT3和IL2RB基因的突變也可激活細胞因子受體參與Ph-likeALL的形成。Ras信號通路突變包括NRAS、KRAS、PTPN11和NF1突變，發生在4%的兒童Ph-likeALL[5]。GATA3蛋白是一種具有結合GATA序列高度保守鋅指結構的轉錄因子。全基因組關聯分析研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）發現兒童Ph-likeALL中GATA3rs3824662單核苷酸多態性（SNP）明顯不平衡，其中A等位基因表達率更高[21]。rs3824662A等位基因不僅致GATA3mRNA表達更高，且多伴隨CRLF2異常、JAK突變及IKZF1缺失，但導致Ph-likeALL發生的具體機制目前仍不明確。

2Ph-likeALL的臨床特征

不同年齡階段Ph-likeALL的發生率不同，在兒童、青少年、年輕成人、成年人及老年人ALL的發生率分別為10%~15%，21%，27%、20.4%和24%[5,22]。在兒童Ph-likeALL人群中，大年齡組患兒所占比例更高，男:女之比為1.5:1，而且西班牙裔發病率更高[2,5,21]。兒童Ph-likeALL初診時外周血白細胞總數偏高，多超過100×109/L[5]；早期治療反應不佳，誘導化療第19天及誘導結束時MRD水平均較非Ph-likeALL組更高[23]。有研究發現，存在EBF1-PDGFRB重排的ALL患兒更易發生誘導化療失敗[24]。多項研究證實，兒童Ph-likeALL具有高復發率和不良預后的特點[5,25]。Roberts等[5]以1725名ALL患者為研究對象，發現各年齡段的Ph-likeALL患兒5年無事件生存（event-freesurvival,EFS）率顯著低于非Ph-likeALL組。美國兒童腫瘤協作組（Children'sOncologyGroup,COG）對772例高危組兒童ALL進行隨訪，Ph-likeALL組5年EFS明顯低于非Ph-likeALL組[10]。此外，各種基因改變類型的Ph-likeALL的預后也不同，以發生JAK2和EPOR重排的生存率更低，伴隨IKZF1異常的Ph-likeALL預后更差[5]。美國St.Jude兒童醫院隨訪344例兒童ALL，依據誘導化療第19天和46天MRD水平調整危險度，高危組患兒優先接受造血干細胞移植治療，雖然結果顯示Ph-likeALL組與非Ph-likeALL組的EFS差異無統計學意義，但是Ph-likeALL患兒進入高危組以及接受造血干細胞移植患兒的比例較高[23]。

3Ph-likeALL的診斷兒童

Ph-likeALL的分子生物學改變呈現高度異質性使其診斷充滿挑戰，目前尚無統一的診斷標準。美國St.Jude兒童醫院對所有新診斷的ALL采用二代測序方法篩選Ph-likeALL，英國研究中心對于早期化療效果差的ALL進行ABL相關重排基因檢測，COG利用良好驗證性的基因芯片對所有新診斷的高危組ALL進行初步篩選，陽性者在誘導化療中進行基因檢測驗證。最早Ph-likeALL的診斷是通過分析基因表達譜與Ph+ALL的相似性來確定，但這較大程度依賴基因芯片的選擇，而選擇不同基因組分析表達譜的結果將會不一致，使其臨床應用受到限制。高通量新一代測序雖可檢測出完整的基因突變，展示基因表達譜，但其昂貴的費用及高度依賴生物信息技術使其不能廣泛推廣。而核型分析、FISH、多重PCR等技術只能檢測到部分異?；?。Yap等[25]針對一些常見的靶向融合轉錄子測序有效檢測到Ph-likeALL眾多異常基因。在Ph-likeALL的診斷中明確異常活化的激酶信號通路有助于靶向藥物的選擇。采用流式細胞術分析JAK2下游的STAT5和ABL下游的CRKL磷酸化水平不僅可明確異常激活信號通路，還能繞過特定遺傳學病變的診斷困境，同時分析酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinaseinhibitors,TKIs）治療前后的相關下游分子磷酸化水平可預測TKIs治療反應能力。此外，兒童Ph-likeALL最常見的分子遺傳學改變為CRLF2的異常表達。正常情況下CRLF2蛋白不會在B細胞中表達，因此可將CRLF2抗體加入到ALL免疫表型的分析中，并且通過FISH、多重PCR、多重交聯探針擴增以及基因組芯片等驗證其基因改變類型。

4Ph-likeALL的治療

Ph-likeALL中約90%存在激酶異常激活，主要為ABL和JAK激酶通路基因異常，因此TKIs治療Ph-likeALL有較好的前景[5,26-28]。ABL抑制劑伊馬替尼（imatinib）、達沙替尼（dasatinib）適用于發生ABL1、ABL2、PDGFRB或CSF1R重排者，JAK抑制劑魯索利替尼（ruxolitinib）可有效抑制JAK-STAT信號通路的異常激活，存在ETV6-NTRK3融合基因者對ALK抑制劑克里唑替尼（Crizotinib）敏感[5,13,29]。Weston等[28]報道1例伴EBF1-PDGRFB易位的10歲男性ALL患兒在常規化療效果不佳后加用伊馬替尼，骨髓迅速緩解并持續完全緩解超過1年。Kobayashi等[30]報道1例達沙替尼單藥成功治療兒童Ph-likeALL。Roberts等[5]對12例接受TKIs治療的Ph-likeALL隨訪，11例獲良好療效。但TKIs治療Ph-likeALL的有效性及安全性還需進一步研究。COG正在進行兩項臨床試驗以檢驗BFM方案鞏固治療階段加入達沙替尼治療ABL重排Ph-likeALL的療效，并評估魯索利替尼聯合化療治療JAK-STAT通路異常激活的Ph-likeALL的療效，以尋找魯索利替尼最佳劑量。2015年中國兒童癌癥協作組（ChineseChildrenCancerGroup,CCCG）啟動ALL2015研究方案（CCCG-ALL-2015），亦將TKIs治療Ph-likeALL納入臨床試驗中。Ph-likeALL中CRLF2重排除涉及JAK-STAT外，還有PI3K、mTOR和BCL2信號通路的異常激活，針對這些信號通路的抑制劑正在進行相關的臨床前和臨床研究[29,31-32]。也有針對Ras信號通路抑制劑治療Ph-likeALL的早期臨床試驗[33]。Tasian等[34]對Ph-likeALL小鼠模型進行研究，發現PI3K/mTOR（phosphoinosmde-3-kinase/themammaliantargetofrapamycin）抑制劑gedatolisib聯合魯索利替尼或達沙替尼的治療效果優于單藥治療，能更大程度抑制白血病細胞增殖。雖然TKIs治療Ph-likeALL顯示良好的研究前景，但接受TKIs治療后仍可能復發或死亡[35]。在細胞株和小鼠模型中發現，對于JAK抑制劑治療效果差者使用熱休克蛋白90（heat-shockprotein90,HSP90）抑制劑可成功抑制白血病細胞增殖及下游信號通路活化[36-37]。在IKZF1突變致白血病的小鼠模型中，維A酸可改善TKIs的耐藥并同時增強TKIs的活性[38]。然而，HSP90抑制劑及維A酸能否用于臨床需進一步研究。

篇7

1 常用白血病MRD檢測方法的研究進展

1.1 分子生物學方法：遺傳學的改變，包括染色體易位/缺失、基因突變等是白血病發生的基礎，其所導致的正?；虮磉_調控紊亂和功能異常是白血病發生的主要原因。異常的遺傳學改變，已成為急性白血病臨床檢驗資料的重要組成部分。

實時定量聚合酶鏈反應( RQ-PCR ) 方法結合了PCR和熒光探針兩種技術，通過定量檢測白血病細胞中標志性基因實時觀測MRD，是目前檢測MRD最為敏感的方法，靈敏度可達10-4-10-5，已成為臨床實驗室建立MRD檢測方法的首選。其檢測的基因標志包括：（1）染色體異位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 細胞受體（T-cell receptor ，TCR）重排等，常見的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表達增高的腫瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）發生突變的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病發展過程中比較穩定,以其作為PCR檢測MRD的分子標志具有特異性強、敏感度高的優點［2］。但是這些檢查不僅價格昂貴，其檢測的標本為RNA，存在不易保存，結果不穩定的缺點。更令人遺憾的是,由于白血病是一組異質性很大的惡性血液病，各亞型之間遺傳背景不同，這些遺傳學基因標志只能覆蓋1/3的白血病類型，還有2/3類型的白血病不具備遺傳學基因標志，無法在臨床上進行MRD的檢測。即使聯合應用多種基因仍有40%～50%的患者無法找到適當的基因標志檢測MRD，使其疾病狀態缺乏準確的判斷依據。

1.2流式細胞術( FCM)：FCM是通過檢測在正常細胞上不表達或低表達而在白血病細胞上表達或高表達的白血病相關免疫表型來定量檢測MRD，能夠準確定量殘留白血病細胞數，并且還能了解殘留白血病細胞的凋亡情況［3］。其優勢是每秒可檢測5 000～10 000個細胞,并能用計算機記錄處理,快速地對各個細胞進行多參數定量分析,靈敏度達到10- 4。但應用此法必須要對患者初發時的免疫表型特征有詳盡了解,以便選擇適當的標志檢測MRD。因為白血病細胞與正常細胞相比, 通常低達10- 5～10- 6, 可能低于FCM檢測范圍而使這種方法缺乏特異性; 而且隨著病程發展, 細胞表面的抗原發生改變, 會導致假陰性結果。

2 異常DNA甲基化檢測白血病MRD的臨床研究進展

DNA甲基化是指在DNA序列不變的情況下，通過影響基因轉錄活性以調控基因的表達。DNA甲基化作為一種表觀遺傳學改變與白血病的發生密切相關，在不改變遺傳信息的前提下導致細胞遺傳特性改變，作為腫瘤性疾病"二次打擊"經典假說的重要補充，已成為白血病研究的新熱點。DNA異常高甲基化導致抑癌基因的失活在白血病發生發展、診斷、監測微小殘留病、預測病情以及指導治療方面都有重要作用，這些表觀遺傳學標志作為MRD監測標志物的臨床研究逐漸引起大家的關注。

P15基因甲基化與白血病的關系目前研究最為深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴細胞白血病(ALL)患者發生p15基因高甲基化，且持續p15基因高甲基化預示疾病復發。與p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明顯延長（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］檢測了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在發展為治療相關的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早為兩年前。提示pl5甲基化發生在t-MDS/AMI 早期，檢測p15甲基化有助于判斷預后、指導治療。在一組65例急性早幼粒細胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年無病生存率僅為29．64％ ，顯著低于34例無甲基化的患者79%。p15基因甲基化與預后不良相關。

Id4和zo-1是我室新發現的兩個血液系統相關候選基因，并對其在白血病發生、復發中的作用及應用于MRD檢測進行了系列基礎與臨床研究。

采用MS-PCR的方法對完全緩解期白血病患者骨髓標本檢測id4基因甲基化狀態，結果發現：（1）58例完全緩解的急性白血病人MRD的檢出率為41%，MRD陽性的患者12個月內復發率為62.5%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為10%。（2）16例異基因外周血干細胞移植后的白血病患者中，5例檢測到MRD的患者中有4例在1年的隨訪期出現復發，而11例移植后MRD持續陰性的患者無一例復發。

研究對26例完全緩解的急性白血病患者進行zo-1基因甲基化檢測，MRD檢出率為34.6%，MRD陽性的患者12個月內復發率為57.1%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為15.4%，MRD陽性病人復發率明顯高于陰性者。Id4和zo-1基因甲基化檢測可能成為急性白血病新的生物標記用于預測疾病的預后以及復發。

隨著PCR 技術的進步，將實時定量PCR（real-time PCR）與MSP 結合提高了甲基化分析檢測的特異性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR為MRD檢測開辟了另一種解決方法。甲基化定量水平的變化對于細胞修復、腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。因此，甲基化定量PCR技術被應用與臨床各領域的研究。

Shuchi等［6］以啟動子區高甲基化狀態的雌激素受體α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做為MRD標志，采用定量甲基化特異性PCR對180例急性白血病患者骨髓標本進行檢測，結果發現：（1）臨床緩解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因啟動子區呈現高甲基化狀態的患者較低甲基化狀態的患者有更高的復發風險，而且ER-α和p15INT4B基因啟動子區甲基化水平的增高與患者無病生存期（disease free survival,DFS）縮短有明顯相關性。（2）對5名兒童ALL患者ER-α基因啟動子區甲基化程度進行了自誘導緩解后的追蹤檢測，結果提示疾病復發狀態較緩解狀態ER-α基因啟動子甲基化水平增加。其結果與目前常用的MRD監測標志TCR/免疫球蛋白重排水平結果基本一致。

另一研究以啟動子區高甲基化狀態的p73、p15、p57KIP2基因為MRD標志，通過對199例Ph染色體和MLL陰性的處于完全緩解狀態（complete remission,CR）的成人ALL標本進行定量甲基化特異性PCR檢測，研究結果提示p73基因啟動子區甲基化水平與第一次CR持續時間及無病生存期（DFS）及總生存期（overall survival, OS）縮短間有顯著相關性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR檢測有可能成為一種評估急性白血病復發風險及MRD檢測的有效手段。

結語

白血病作為一種惡性腫瘤，復發是影響其患者生存的主要問題?；颊唧w內白血病微量殘留病是復發的主要根源，對患者進行微量殘留病監測在白血病的治療和預后判斷中具有非常重要的意義。遺憾的是，由于絕大多數患者缺乏明確的遺傳標記作為早期檢測和準確評估MRD的標志，在臨床上常因治療不足導致疾病復發或治療過度引起嚴重并發癥，絕大多數患者在發病后1~3年內死亡。因此，要在白血病MRD早期檢測和指導治療上有所突破，就必須尋找能夠早期診斷白血病MRD的特異性強、通用性好的分子標志物。DNA 甲基化作為腫瘤相關標記，與遺傳學標記、細胞表面抗體等標志具有更多的優勢。首先，臨床常規的腫瘤標記檢測以蛋白或者RNA為對象，必須采集新鮮樣本以確定檢測結果的準確性。而甲基化檢測則以DNA 為樣本，很容易從各種體液中，甚至石蠟包埋組織中得到，極大地擴展了研究資源。其次，甲基化以DNA作為研究對象，較RNA 和蛋白更穩定，更容易保存。進而保證了檢測結果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的變化對于腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。

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流行病學研究證實，高血壓、糖尿病、高脂血癥、同型半胱氨酸血癥、C反應蛋白增加、纖維蛋白原升高、吸煙、肥胖、呼吸睡眠暫停、長期慢性感染、卒中、反復發作的短暫性腦缺血發作和缺血性心臟病等是血管病變的危險因素，也是CSVD與VaD共同的危險因素?。對CSVD和VaD的危險因素進行遺傳學研究，進而對其進行有效干預和一級預防對避免卒中和VaD具有重要意義。

基金項目：國家自然科學基金（1160472)；廣西科學研究與技術開發計劃項目：（桂科攻1550054-5)；柳州市科學研究與技術開發計劃：（201F010401)11脂質代謝異常脂質代謝異常是CSVD和VaD的共同危險因素。分子遺傳學研究發現，膽固醇從頭合成的調節劑--固醇轉錄因子調節元件結合蛋白1等位基因攜帶者患癡呆的風險更高；在癡呆患者中，膽固醇"24S-羥化酶的水平有顯著改變M。而在CSVD中，高膽固醇水平對于腦小血管的影響顯而易見，其直接促成腦血管的脂質透明變性,進而引起腦的小血管病變M。

另外一個與癡呆相關的基因是載脂蛋白E4(apolipopro-teinE4,apoE4)的等位基因，它與其他風險因素協同作用直接影響CSVD。上海的一項調查研究證實，VaD患者apoE4出現的頻率顯著高于正常對照組6。另一項研究表明，apoE4的基因多態性與20%的VaD有關。一項關于中國人VaD與apoE4關聯性的薈萃分析表明，apoE4基因多態性與中國VaD患者的發病相關,研究還指出apoE4的等位基因增加患VaD的風險，而apoE的等位基因有防止VaD的作用。

基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMPs)的功能是重構組織損傷和修復過程中的細胞外基質。目前為止，此家族有名成員與VaD相關。與VaD相關的MMP4基因啟動子位于（1G/2G,-1607bp),由于鳥嘌呤的插入或缺失，致使2G等位基因和基因型的存在（2G2G和1G2G),進而增強轉錄相關基因的活性[1647]。研究表明，與AD患者及正常對照組相比,VaD患者腦脊液中MMP~9的水平明顯升高,進一步分析發現，MMPs的三種啟動子位點合并基因型能增強VaD的易患性。

12血管血壓因素腦血管出血或梗死與患者的凝血功能息息相關，纖維蛋白原和凝血因子在其中扮演著重要角色。纖維蛋白原基因多態性基因型A與梗死風險相關，隨著纖維蛋白原水平的升高，VaD的風險明顯升高。研究表明，纖維蛋白原基因啟動子A等位基因將增加腔隙性腦梗死的風險。在凝血因子MVal4Leu的多態性研究中，M的纈氨酸等位基因通過增加纖維蛋白的溶解阻力，增加血栓形成風險。凝血因子V、凝血酶原、纖維蛋白原、纖溶酶激活物 以及其他蛋白抑制劑與非遺傳性小血管梗死和VaD的風險相關62。白細胞介素6和細胞間黏附分子1基因的多態性與缺血性腦梗死顯著相關，其組合更增加了缺血性腦梗死的發生風險2。血管內皮型一氣化氮合酶有增加不完全皮質下梗死和VaD的風險。關于血管內皮型一氣化氮合酶基因型G94T和94TT的多態性研究表明，兩者與亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)的C677TT多態性及血管緊張素轉換酶的D/D基因型協同關聯,增加缺血性腦梗死的風險，可與高血壓、糖尿病、吸煙、酗酒等進一步產生協同效應。

血管緊張素轉換酶的D/D基因型和MTHFR的C677TT基因型與不完全皮質下梗死及VaD的發病相關,認為其是腦白質病變的獨立危險因素，與腦白質的改變以及認知功能衰退密切相關M。此外,MTHFR的C677TT基因型與血管緊張素轉換酶的D/D基因型表現出協同效應。但目前關于血管緊張素轉換酶D/D基因型與腦卒中及VaD的研究尚存在爭議,這可能是由種族差異或其他協同因素造成的,也可能是樣本量的問題。

1炎癥與氣化應激因素同型半胱氨酸水平的升高可產生過多的活性氣并抑制一氣化氮合酶，進而造成血管功能障礙；同時同型半胱氨酸又促進脂蛋白a與纖維蛋白結合，產生自由基,促進低密度脂蛋白氣化，進一步導致卒中發作和VaD發生。

MTHFR是同型半胱氨酸代謝的主要酶類之一。MTHFRC677T的多態性與年輕患者的腦缺血相關,其TT型基因與無癥狀腦梗死及腦白質病變相關2。

血小板內皮細胞黏附分子1是白細胞跨內皮遷移的關鍵介質,其基因的多態性是冠狀動脈疾病與血清血小板內皮細胞黏附分子1水平的共同風險因素，其水平的升高增加了腦梗死的風險,可能與VaD發病及再次加重相關。

谷胱甘肽-轉移酶1具有抗氣化應激作用，其外顯子4(Ala140Asp和Glu155Glu)是基因的兩個錯義突變。研究表明，谷胱甘肽-S-轉移酶1Ala140Asp多態性降低了酶的活性，降低了抗氣化應激的作用，增加了腦梗死和VaD的易患風險。

14其他研究證實,新發現的17q25基因位點與缺血性卒中的白質高信號相關,特別是與rs994的多態性有關。同時此研究進一步說明，17q25單核苷酸的多態性與腔隙性腦梗死并無關聯。雖然17q25基因位點與白質高信號有關，但并不是通過責任血管和小血管促進梗死發生，具體原因還未見相關報道。

最近的一項全基因組關聯研究也未發現VaD與散發性CSVD間存在確定的遺傳關聯。研究表明，腫瘤壞死因子基因的啟動子（C-770T的T序列和TTGAT)表達的降低可增加女性患VaD的易患性。非受體酪氨酸激酶SYK基因的內含子的rs290227多態性增加患VaD風險。對血小板白細胞C激酶底物同源性結構域B家族2成員的相關性研究也傾向于其對VaD有遺傳易患性。

2單基因遺傳性CSVD與VaD的遺傳學研究

單基因遺傳性CSVD主要有家族性淀粉樣腦血管病(familialcerebralamyloidangiopathy,FCAA)、伴有皮質下梗死

和白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈?。╟erebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleukoen-cephalopathy,CADASIL)、伴有皮質下梗死和白質腦病的常染色體隱性遺傳性腦動脈病（cerebralautosomalrecessivearteri-opathywithsubcorticalinfarctsandleukoencephalopathy,CARA-

SIL)、伴視網膜病的遺傳性小血管病、彌漫性軀體性血管角化瘤病等。

FCAA是一種因淀粉樣蛋白積聚在血管壁導致的卒中和VaD,其至少包括以下幾種類型：荷蘭型，是由第21號染色體APP695基因的61位密碼子發生了G-C的單一位點突變；冰島型，位于20p112的CC基因外顯子CTG突變為CAG,并存在限制性內切酶識別位點的缺失；此外還有Flemish突變、北極型突變、愛何華型突變等。散發性FCAA主要與載脂蛋白E基因、早老素基因、a抗糜蛋白酶基因、腦啡肽酶基因、Ap降解酶以及轉錄生長因子h等的基因突變有關。

CADASIL的致病基因是Notch基因，現已發現190多種Notch基因多態性與CADASIL有關。Notch基因位于表皮生長因子受體的串聯重復區，其基因突變導致半胱氨酸殘基的增益和損失,影響血管平滑肌功能和血管內環境的穩定，導致這些血管平滑肌細胞凋亡缺陷，影響微血管功能，繼發神經元損傷。

CARASIL的主要癥狀與CADASIL相似,半數患者有卒中發作,而無卒中癥狀的患者主要表現為進行性腦功能損害，也可出現精神癥狀。研究表明，HTRA1基因突變與CARASIL

有關。

伴視網膜病的遺傳性小血管疾病主要有種類型，其中遺傳性視網膜病未見有癡呆病例報道；伴視網膜■腎病^卒中的遺傳性內皮細胞病雖有卒中癥狀,但也未見癡呆病例報道；大腦視網膜血管病有卒中和癡呆癥狀。三者的致病基因均定位于p211~p21,屬常染色體顯性遺傳。目前研究認為，伴視網膜病的遺傳性小血管疾病致病基因位于p211~p21的DS157~DS564區域，具點尚未見報道。

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本文通過近年來發表的相關文獻，對NER系統基因XPD單核苷酸多態與腫瘤的遺傳易感性進行了綜述。

1 XPD基因生物學特征及功能

XPD位于人類染色體19q13.3，長約54.3kb，轉錄產物大小為2283bp，由760個核苷酸組成，其中42～49位為ATP結合位點；682～695位為潛在的核定位信號。XPD基因包含23個外顯子，所有的內含子在結合位點均具一致的GT/AG序列，在該基因上有135個SNPs。XPD是一種進化保守的ATP依賴的DNA解旋酶，是核苷酸切除修復途徑中的重要一環，涉及核苷酸切除修復和堿基轉錄，它是Ⅱ型轉錄因子H （TFⅡH） 復合體的重要組成部分，一方面參與NER，另一方面還參與轉錄。大約2/3基因突變位于XPD蛋白的C-末端，而C-末端是與p44的結合區，它們共同構成TFⅡH 復合物[4]。

2 XPD基因單核苷酸多態與肺癌遺傳易感性

目前，肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一。有研究發現XPD基因的rs1799793和rs13181這兩個位點的單核苷酸多態性與肺癌發生密切相關[5]；同樣，Zhan等[6]的Meta分析結果也顯示XPD基因的Lys751Gln和Asp312Asn多態性與肺癌發病風險相關，其中Lys751Gln基因型的C等位基因會增加歐美人中吸煙者患肺癌的風險，而Asp312Asn基因型的A等位基因則會增加亞洲人中吸煙者的患病風險；王芳等[7]研究發現XPD基因多態可影響焦爐工DNA損傷水平，但是與肺癌易感性無關聯；盧火緄[8]的研究顯示XPD751Lys/Lys基因型個體中，吸煙患者更容易罹患肺癌。

3 XPD基因單核苷酸多態與結直腸癌遺傳易感性

結直腸癌 （colorectal cancer， CRC） 是世界上常見的惡性腫瘤之一，每年死亡人數達到60萬，以新西蘭、歐洲及北美等發達國家發病率最高，是非洲及亞洲中部等發展中國家的2～5倍[9]。盡管我國結直腸癌發病率相對較低，但近幾年也有明顯上升趨勢。結直腸癌的發病機制尚未明確，大量的流行病研究結果認為結直腸癌的發生發展與吸煙、酒精、肥胖等危險因素呈正相關。于兆亞等[10]研究顯示XPD751基因突變型個體可增加罹患結直腸癌的風險。目前，國內關于XPD Lys751 Gln基因多態性與結直腸癌易感性的研究較多，但研究結果不盡相同，且樣本量小，有待進一步驗證。

4 小結

綜上所述，XPD基因單核苷酸多態與腫瘤遺傳易感性關系的研究，應深入評價基因型-表型相關性和基因-基因、基因-環境的交互作用，從而闡明疾病發生的分子遺傳學機制，研究和確定與各種疾病易感性相關的危險基因型，將其作為分子標志物用于篩選高危人群或易感個體，同時估計人群發病風險，從而采取有效干預措施，預防腫瘤的發生，對疾病的早期診斷和早期治療將具有重要意義。

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鄺仕成

（海南省人民醫院藥學部，海南 5703111）

預防醫學雜志： 2012， 13 （1）： 30-35.

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中圖分類號r459.9文獻標識碼a文章編號 1007-5739(2010)01-0025-01

美國是世界上最早開展基因治療的國家,也是目前開展基因治療最多的國家。我國在1991年7月開始基因治療的臨床研究,最早的工作是對b型血友病的基因治療及利用抑癌基因對癌癥的基因治療[1]。基因治療目前主要用于治療對人類健康威脅嚴重的疾病,包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。

1基因治療的方式

1.1體內基因治療

體內基因治療是指將具有治療功能的基因直接轉入病人的某一特定組織中。利用反轉錄病毒載體已成功地將真核基因轉入動物細胞,但通過質粒dna的直接操作,將更加省時而且產量較高;采用溫和病毒載體的體內基因治療主要是通過腺病毒和單純皰疹病毒來完成的,即將載有矯正基因的載體直接注射入需要這些基因的組織。以腺病毒為載體的體內療法在遺傳性疾病方面,目前主要見于囊性纖維變性的基因治療研究。多數研究表明,基因治療糾正了呼吸道上皮的氯離子轉運缺陷,使跨上皮基礎電位下降,肺功能有所改善[3]。

1.2反義療法

反義療法主要是通過阻遏或降低目的基因的表達而達到治療的目的。反義療法是通過引入目的基因的rna的反義序列而達到上述目的。當引入的反義rna與mrna相配比后,用于翻譯的mrna的量就大大減少,因而合成的蛋白的量也相應大大減少。引入的反義序列也可能與基因組dna互補配對,從而阻遏mrna的轉錄。這2種情況都會使細胞中靶基因編碼的蛋白合成大大減少,以達到基因治療的目的。

1.3通過核酶的基因治療

20世紀80年代初,美國科學家cech和altman發現了核酶,核酶是指由rna組成的酶,能夠序列特異性地抑制靶mrna。近年來,核酶在抑制癌基因的表達[4]、增強腫瘤對藥物的敏感性及抑制腫瘤血管的生成等方面的應用得到了廣泛的研究。

1.4自殺基因療法

自殺基因療法是惡性腫瘤基因治療領域最有希望的方法之一,已廣泛用于各種惡性腫瘤的基礎研究和臨床試驗性治療。它是用藥物敏感基因轉染腫瘤細胞,其基因表達的產物可以將無毒性的藥物前體轉化為有毒性的藥物,影響細胞的dna合成,從而引起該腫瘤細胞的死亡。

2基因治療存在的問題

2.1基因治療的社會和倫理問題

基因治療不僅僅是一種醫療方法,它還涉及很多其他問題。因為當人們試圖“糾正”人類自身“不正常”的基因時,這種糾正的后果是無法預料的。由于人類的遺傳信息非常復雜,轉基因也可能帶來不可預料的后果,沒有人能保證這種基因結構的改變絕對不會造成人類某一未知功能的缺失。另外,當人們試圖把基因治療引入生殖細胞時,又涉及后代基因結構的改變問題,且改變將直接影響這個“未來人”,這是一個很難解決的倫理問題。

2.2基因治療的技術問題

目前,基因治療的對象是單基因的缺陷,但許多疾病涉及多個基因之間復雜的調控和表達關系。對這類疾病的基因治療難度很大,因為向細胞中導入多個基因后,使幾個基因之間能保持正常的調控關系幾乎是不可能的。即使是單基因缺陷癥,使導入細胞的基因能正常表達也是一個較復雜的問題。將基因導入細胞后,其表達量的多少是直接影響能否達到治療的目的和有無副作用的關鍵。但這個問題將會在人類基因組計劃完成的基礎上,對人類后基因組計劃的開展,弄清了人類基因之間復雜的調控聯系后而最終得到解決。只有這樣,才能在基因治療中盡量做到使導入的基因處于正確的調控下,取得治療效果,消除副作用。

3展望

以基因轉移為基礎的基因治療要在臨床上很好地應用,還有待理論和各種技術的進一步發展。過去20~30年基因治療的發展已取得了巨大成就,已被看成是對先天和后天基因疾病的潛在有效的治療方法,不過其依然存在缺少高效的傳遞系統、缺少持續穩定的表達和宿主產生免疫反應等問題。今后基因治療研究將向2個方向發展:一是基礎研究更加深入,以解決在臨床應用中遇到的一些困難及基因治療本身需要解決的一些難點;二是臨床試用項目增多,實施方案更加優化,判斷標準更加客觀,評價效果更加精確?？傊?隨著分子生物學、分子遺傳學以及臨床醫學的發展,基因治療也會不斷發展,日趨成熟,很多難題會得到解決,并在臨床上得到廣泛應用。整理

4參考文獻

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