山葡萄C4H基因的克隆表達及遺傳轉化分析
關鍵詞：山葡萄 克隆 c4h基因 原核表達 遺傳轉化
摘要：通過生物學技術來研究C4H基因在山葡萄著色過程中的作用,進而揭示山葡萄果皮著色的分子機理;利用RT-PCR技術克隆了山葡萄C4H基因的全長cDNA序列,并對該蛋白進行生物信息學分析,預測其功能;利用實時熒光定量PCR檢測C4H基因在山葡萄8個不同轉色時期的表達量,將克隆獲得的山葡萄C4H基因完整的ORF連接到原核表達載體pET28a上,轉化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3),并通過不同濃度的IPTG誘導表達,SDS-PAGE檢測表達產物.為了驗證山葡萄C4H基因的功能,構建了表達載體pCC4H并轉化農桿菌GV3101.用菌液浸泡花序法對擬南芥進行遺傳轉化,在含50mg/LKan的培養基上對T0代種子進行篩選.克隆獲得的山葡萄C4HcDNA全長1735bp,開放閱讀框1518bp,編碼505個氨基酸,該基因表達產物分子質量為57.70KDa,等電點值9.06.C4H基因在山葡萄果皮轉色各個時期均存在表達;該基因原核表達產物與預期大小一致,表明原核表達成功,擬南芥遺傳轉化先后得到3個陽性幼苗.對移栽成活的2株抗性植株進行PCR檢測為陽性,2株葉片顏色均變成紫紅色;經花色素苷質量濃度的測定表明其質量濃度比對照組植株高出3倍.在擬南芥中花色素苷質量濃度雖然較低,但還是能少量合成,說明其花色素苷生物合成途徑是開通的,只是積累的量較少.
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