癌相關(guān)成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體在促骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中作用的實(shí)驗(yàn)研究
關(guān)鍵詞：骨肉瘤 外泌體 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞 肺轉(zhuǎn)移 腫瘤微環(huán)境
摘要：目的探討癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)來(lái)源的外泌體對(duì)骨肉瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的影響。方法利用人源骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2采用差速貼壁法分離、培養(yǎng)CAFs,顯微鏡下觀察CAFs的形態(tài),免疫組織化學(xué)觀察α-SMA蛋白表達(dá)對(duì)CAFs進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)CAFs,采用ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒分離外泌體。通過(guò)透射電鏡觀察外泌體形態(tài),Western blot檢測(cè)外泌體特異性標(biāo)記蛋白β-actin、CD63表達(dá)情況對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)人源骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2,分為外泌體組和對(duì)照組,采用細(xì)胞劃痕及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察外泌體對(duì)Saos-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。選取一級(jí)5周齡BALB/c-nu雌性裸鼠12只,按編號(hào)隨機(jī)分為外泌體組和對(duì)照組,每組6只。兩組均采用皮下移植成瘤法在裸鼠右側(cè)背部皮下接種人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞與Matrigel基質(zhì)膠混合懸液,建立裸鼠骨肉瘤腫瘤模型。造模結(jié)束后即刻進(jìn)行尾靜脈注射:外泌體組每只裸鼠通過(guò)尾靜脈注射濃度為0.1μg/μL的外泌體懸液30μL,對(duì)照組裸鼠尾靜脈注射等量生理鹽水,兩組均1次/周,共注射6次。第1次注射后每日觀察裸鼠成瘤情況,從裸鼠右側(cè)背部皮下可觸及腫塊開(kāi)始,測(cè)量?jī)山M裸鼠腫塊的最長(zhǎng)徑和最長(zhǎng)徑的最大垂直短徑,計(jì)算腫瘤體積,此后每周測(cè)量1次,共測(cè)量6次。完成最后一次測(cè)量后腹腔麻醉斷椎法處死裸鼠,完整取出腫塊并稱(chēng)重。取裸鼠肺組織進(jìn)行切片HE染色觀察兩組裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯微鏡下觀察CAFs呈長(zhǎng)梭形,排列雜亂,無(wú)方向性;細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:CAFs的α-SMA蛋白表達(dá)陽(yáng)性,提示CAFs提取成功。電鏡觀察外泌體呈70~100 nm圓形或橢圓形膜性囊泡狀結(jié)構(gòu);Western blot結(jié)果顯示外泌體中CD63蛋白呈高表達(dá),β-actin蛋白表達(dá)較弱,提示成功分離CAFs來(lái)源外泌體。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:外泌體組細(xì)胞遷移距離、遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為(0.19±0.02)mm、0.81%±0.11%?
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