靶向去唾液酸糖蛋白受體多功能分子的構建及抗肝癌效應
關鍵詞：癌 肝細胞 基因治療 融合蛋白
摘要：目的構建具有靶向去唾液酸糖蛋白受體、溶酶體逃逸、DNA結合的多功能融合蛋白，并對表達產物進行功能鑒定。方法合成編碼Melittin的兩條寡核苷酸單鏈（GenBank：X02007），退火形成寡核苷酸雙鏈；雙酶切含抗去唾液酸糖蛋白單鏈抗體（ASGPRseFv）c1基因的載體C1／plT2，0．7％低融點瓊脂糖凝膠回收C1；以pSW50．Gal4為模板，通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增Gal4基因；采用分子克隆技術將其定向克隆至載體pGC4C26H中，獲得重組質粒C1MG／pGC4C26H；雙酶切載體C1MG／pGCAC26H，膠回收片段C1MG定向克隆至載體pET-32c中，將含C1MG／pET-32c的B121單菌落1：100接種至1000mlLB肉湯培養基中培養，并通過IPTG誘導表達。表達產物用Ni“螯合柱親和純化，免疫印跡技術（Western blot）和免疫組織化學分析重組蛋白C1MG的抗原結合能力，溶血實驗分析C1MG的生物學活性，腫瘤細胞生長抑制實驗分析C1MG的DNA結合能力。結果成功構建原核表達質粒C1MG!pET．32e，并經測序證實：在大腸桿菌BL21中有效表達重組融合蛋白C1MG；表達產物以包涵體形式存在；純化的C1MG大小為64．1kDa，濃度為0．6g／L；Westernblot結果說明C1MG能有效識別重組ASGPR，免疫組織化學結果證實C1MG能結合到鼠肝細胞表面；溶血實驗顯示C1MG具有裂解紅細胞膜功能；腫瘤細胞生長抑制實驗證實C1MG將pEBAF／tk-GAL4rec質粒有效地導入表達ASGPR的細胞中并表達TK基因，氯喹對腫瘤細胞生長抑制無明顯影響。結論在大腸桿菌中成功表達和純化得到單鏈抗體一蜂毒肽一酵母轉錄因子（C1MG）的融合蛋白，該融合蛋白至少具有以下功能：ASGPR靶向識別能力、溶酶體膜裂解功能、以及DNA特異性結合功能，提示對肝癌的靶向治療有潛在的應用價值。
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